단백질 분리 및 정제
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작성일 23-03-09 21:50
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다. 추가적으로 phosphatase inhibitor를 넣어 우리가 확인하려는 pERK의 activation 상태를 유지시킨다. insulin acute stimulation은 990㎕의 KRP와 10㎕의 insulin을 cell에 처리하여 37℃의 water incubator에 10분간 stimulation을 한다.
이 세포 추출물들을 tube에 담아 centrifuge로 분리하여 상등액에 있는 단백질들을 추출.
Cell extraction buffer 150ml를 세포 위에 뿌려주고 scraper로 긁어주어 화학적인 분해뿐만 아니라 물리적으로도 세포가 분쇄되도록 한다.
단백질 분리 및 정제
Acryamide-bisacrylamide 29:1 : solvent의 역할을 하며, 매우 강력한 신경독성(neurotoxic)을 나타내며 이 결과 는 축척 되기 때문에 꼭 장갑을 착용하여야 한다.
Suction pump로 KRP를 제거하고 ice cold PBS로 washing한다.
Gel 만들기 – 이 과政府(정부)터 직접 실습한 내용임.
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쥐의 아세포에서 추출한 NIG-3T3 cell을 growing condition(10% Calf serum/ DMEM, 5% CO2, 36.5℃)에서 배양한다. 추가적으로 phosphatase inhibitor를 넣어 우리가 확인하려는 pERK의 activation 상태를 유지시킨다.
설명
Extraction Buffer(=lysis buffer) : Tris, TritonX-100, NP-40, SDS 등 여러 가지 detergent들이 cell wall과 mitochondria membrane을 깨트려주고 아래의 표에 제시된 protease inhibitors들이 세포 안의 protease가 단백질을 분해하는 것을 막아준다. 이는 세포의 대사를 멈추고 osmosis가 발생하지 않기 위함이다.
Extraction Buffer(=lysis buffer) : Tris, TritonX-100, NP-40, SDS 등 여러 가지 detergent들이 cell wall과 mitochondria membrane을 깨트려주고 아래의 표에 제시된 protease inhibitors들이 세포 안의 protease가 단백질을 분해하는 것을 막아준다.
Principle:
단백질 분리,단백질 정제
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순서
Purpose : Electrophoresis에 사용할 Acrylamide Gel을 만든다.
Suction pump로 배지를 제거하고 KRP Buffer를 사용하여 세포를 두 번 washing한다.
